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    用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標(biāo)記哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-08  點(diǎn)擊次數(shù): 2031次
    材料與儀器

    細(xì)胞
    培養(yǎng)基

    實(shí)驗(yàn)步驟

    1. 制備活躍生長(zhǎng)著的細(xì)胞。從單層培養(yǎng)細(xì)胞(約鋪滿 75% 表面積)中吸去培養(yǎng)基。用預(yù)熱至 37℃ 的無血清培養(yǎng)基沖洗兩次(培養(yǎng)基中應(yīng)該不含蛋氨酸和半胱氨酸)。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,通過 400 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸沉淀,400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清,用無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 107 細(xì)胞/ml 后轉(zhuǎn)移至一塊小培養(yǎng)板。

    2. 加入預(yù)熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基,于 37℃ 培養(yǎng) 20 分鐘,以耗盡胞內(nèi)含硫氨基酸庫(kù)。

    3. 吸去培養(yǎng)基,立刻換上預(yù)熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標(biāo)記氨基酸的新鮮培養(yǎng)基,依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將細(xì)胞于 37℃ 培養(yǎng)一定時(shí)間(對(duì)于末做過預(yù)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì),以 2~4 小時(shí)作為初始值比較合適)

    4. 移去放射性培養(yǎng)基。對(duì)于單層培養(yǎng)細(xì)胞,吸出即可。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞則可轉(zhuǎn)至試管,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

    5. 準(zhǔn)備一塊凍至 0℃ 的平板(如放在冰盒上的鋁板),將單層細(xì)胞培養(yǎng)板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次,沖洗液都到進(jìn)放射性廢料桶。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞用 PBS 重懸,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

    6. 抽干細(xì)胞上殘留的 PBS,裂解細(xì)胞。


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