原理

材料與儀器

完整的人角膜
CMF-SaIineG 中性蛋白酶II L型膠原酶 1mg ml在DMEM F-12 GASP中 CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶 DMEM F-12 GASP DMEM F-12 2FB GASP:DMEM F-12 GASP含2%FBS CMF GASP
3.5cm塑料組織培養(yǎng)皿或6孔板 手術(shù)刀或單刃的安全刀片 細(xì)胞濾網(wǎng) 70μm血液尼龍過(guò)濾網(wǎng) 塑料刮片 “CellLifter"或“CellScraper" 彎虹膜剪 11cm(4-3 8in.) Jeweler’s鑷 10cm(4in.) 角膜剪 19mm刀刃 尖頭 Colibri縫線(xiàn)鉗 0.1mm

步驟

(a)用CMF-SalineG清洗角膜3×5 min。

(b)剪除殘留的鞏膜，結(jié)膜和虹膜。

(c)加人2ml 1.2U中性蛋白酶II，4℃搖床搖動(dòng)過(guò)夜。

(d)將加入中性蛋白酶II的角膜4℃搖30 min。

(e)用DMEM/F-12/GASP洗滌角膜。

(f)解剖顯微鏡下，小心去除上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。

(g)用塑料刮片輕刮基膜的上皮細(xì)胞面和內(nèi)皮細(xì)胞面。顯微鏡下觀(guān)察，以確保完-全去除這些細(xì)胞層。

(h)用新鮮培養(yǎng)基清洗角膜基質(zhì)一次。

(i)用手術(shù)刀或安全刀片或精細(xì)手術(shù)剪將基質(zhì)剪碎成2 mm左右的小塊。

(j)用DMEM/F-12/GASP配制的膠原酶37℃消化3 h,直到大多數(shù)組織消失。

(k)400g離心10 min,棄上清。

(l)用DMEM/F-12/GASP重懸細(xì)胞，用70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾消化液，并離心。

(m)重復(fù)上述清洗步驟兩遍，每遍之后細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(n)用MJM將分離出的間質(zhì)細(xì)胞重懸并以1×104cm2的密度接種于塑料組織培養(yǎng)皿中。

(o)每3天更換一次培養(yǎng)基。

(P)當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代：吸出培養(yǎng)基，用CMF-SalineG洗一次。加人胰蛋白酶或TrypLE至僅僅覆蓋細(xì)胞，37℃，10 min。加人DMEM/F-12/2FB終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)。將重懸的細(xì)胞離心，棄上清。用足量新鮮配制的MJM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，以1×104cm2的密度接種

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